2017诺贝尔生理学或医学奖，果蝇助攻，带你解读生物钟机制

理论上与生物钟相关的问题中zui重要的，是迄今理解不多的睡眠。理解生物钟可以解释睡眠的相位（何时睡），但不能解释睡眠本身。睡眠的机理目前理解很少。教科书中睡眠的内容相当大部分是脑电图的描绘，是现象的描述不是机理的理解。

2017年诺贝尔生理学或医学奖授予三名美国科学家迈克尔·杨（Michael W Young）、杰弗理·霍尔（Jeffrey C Hall）、迈克尔·罗斯巴希（Michael Rosbash），以表彰他们在研究生物钟运行的分子机制方面的成就。

 评奖委员会说，人们过去知道，包括人类在内的许多生物都有内在的生物钟，但其中原理却长期不清楚。这些科学家以果蝇为对象，分离出能够控制昼夜节律的基因，并在分子层面揭示了相关蛋白质的工作机制。

运气，外在而缥缈；

勇气，内生而实在。

运气不会寻找勇气；

勇气可能碰到运气。

在研究生物钟基因的过程中，事先难以预料能否取得突破，事后分析发现勇气足以成功，而运气是锦上添花，虽然花开的特别灿烂。

生物钟是生物体内周而复始的节律，如人们熟知的：动物的昼行夜伏、植物的春华秋实…。常见的近24小时昼夜节律（circadian rhythm）是典型的生物钟之一。

生物钟现象看似简单，其实不尽然。人们熟知的向日葵朝向太阳，并非每天太阳先出来、向日葵后转向，而是向日葵先朝向、而后才有太阳姗姗来迟。

生物钟的本质难以入手，研究不容易。人们用电生理方法研究而不得入门，1971年从果蝇的一个基因出发开启了生物钟的基因研究，23年后才发现哺乳动物*个生物钟基因的突变，26年后明确哺乳类的生物钟基因与果蝇的类似，30年后才发现同果蝇一样的基因也控制人类生物钟。

驱动生物钟的内在机理随着一个一个基因的发现和研究，逐渐明朗，从果蝇到人存在同样一批控制生物钟的基因，它们编码的蛋白质合作共事，节律性地调节细胞内的基因转录，都采用了负反馈模式，并与光和温度等外界因素协调，从而对应于地球自转的近24小时节律。

生物钟的存在和意义

生物节律与其他节律一样，有震荡的幅度、周期、相位。

节律是生物钟的外在表现，生物钟是内在的定时机理。生物钟本身是自我维持的生理和行为节律发生器（pacemaker），可以受外界环境因素（zeitgebers）所导引、从而同步化。

生物有多种节律，不同的生物有着不同的节律，同一生物也有多种节律。有些动物每年一个周期的冬眠、有些植物每年一个周期的长叶落叶，动物还有更快的周期如呼吸和心跳…，而人们熟知的节律是昼夜节律。不仅大家熟悉的睡眠有昼夜节律，很多其他行为和生理指标也有昼夜节律。

现在知道，从简单的单细胞蓝绿藻（cynobacteria）细菌到多细胞的人，很多生物有生物钟的存在，但并不清楚是否所有地球上的生物都有昼夜节律。昼夜节律周期接近24小时（常见22至25小时）。在环境线索缺乏时可以继续维持，节律的相位由zui后一次环境线索（如光、或温度等）所确定。在环境噪音中，节律照常运行。在一定范围内，节律周期并不随温度的改变而剧烈改变，有温度补偿机制，这不同于一般生化反应：如温度每上升10℃，酶的催化活性提高一倍。

昼夜节律的生物学意义目前仍不清楚。当然在进化过程中，生物活动与地球自转相匹配，也许可以节省能量、或提率。但如果没节律又会怎么样呢？蓝绿藻有昼夜节律，把正常的蓝绿藻与生物钟周期异常的细菌在一起长期培养，发现zui后生物钟正常的细菌占了绝大多数，由此可见生物钟对生物体有利（Ouyang et al., 1998；Woelfle et al., 2004）。拟南芥的研究也观察到，周期缩短或延长的拟南芥，其固碳量、生长、存活都是与环境设定昼夜周期相吻合的拟南芥，即：短周期突变株在20小时昼夜环境下生活得更好；而长周期突变株在28小时的模拟环境下更好（Dodd et al., 2005）。这些观察，反映了只有当内外源周期保持一致时才zui有利于植物生长。观察到周期正常有利于植物，不等于能够解释为什么，所以我们仍然是知其然、不知其所以然。

偷懒是创新之母

遗传筛选的实验设计是：建立检测表型的方法，用致变剂诱导特定生物的不同基因发生突变，检测不同突变种的表型。具体到果蝇的生物钟，就应该是建立检测生物钟的方法，用化学诱变剂诱导不同基因突变，然后一只一只检测果蝇，以便发现改变了昼夜节律的突变种。

当时没人知道果蝇有约两万个基因，化学分子诱发随机突变，只做两万只果蝇不够，其中部分突变在相同基因，所以应该加几倍，才可能大部分基因都突变过一次。因行为有漂移，一个基因的突变种，不能仅检测一只果蝇，应该检测几只到几十只。果蝇是二倍体，每个基因有两套，一套坏了可以被另一个等位基因所代偿，所以不要做子一代（F1）的筛选，而是F2代，传代后再筛选，而F2代只有四分之一是同一基因突变的纯合子那么需要筛选的数量应一两百万，才算做过全基因组的筛选。

检测果蝇昼夜节律的标准方法，是将单只果蝇放到透明的管中，管子只容一只果蝇来回走动。一束光射过小管的中央，凡是果蝇走过管中央，计算机就记录果蝇运动了一次。以此检测果蝇活动的变化，发现确实有昼夜规律。如检测很多果蝇，工作量比较大。

Konopka和Benzer用了两个偷工减料方法来加快速度。其一是果蝇遗传学*的attached X，可以快速检测X染色体的突变。其二是他们决定不筛选昼夜节律，而筛另一节律：果蝇羽化。果蝇受精卵成为胚胎，发育成为幼虫，三次蜕皮后成为蛹，蛹经过羽化成为成虫。

昼夜活动节律是果蝇成虫每天经历一次、几十天周而复始的循环。而果蝇一生仅羽化一次。羽化一般在黎明前，zui迟也在上午。三十年代到五十年代的研究明确提出羽化为独立于温度的生物钟所控制（Kalmus，1935，1940a，1940b，Pittendrigh，1954）。但是，一生一次的羽化的生物钟与成虫每天的活动生物钟，是否有关，当时并不清楚。

Konopka觉得羽化作为筛选方法很容易操作。用单只果蝇做经典的昼夜活动规律检测比较慢。如果用羽化作为筛选方法，就很便当：化学诱变处理得到各种突变的果蝇猴，Konopka每天上午不来上班，午后到实验室把所有羽化的果蝇倒掉，留下其他蛹，下午到晚上再羽化的就是影响节律的突变种，因为它们的羽化时间不同于正常（所谓“野生型”）果蝇。这样的方法大大简化了检测、加速了筛选。

运动监视器

羽化监视器

对于一个研究生来说，用如此简单的方法，不难筛选几万只、几十万只、几百万只果蝇。但Konopka只筛选了不到两百种品系的果蝇就得到*个突变品系，继续筛选不到两千种品系的果蝇再得到两个突变品系。

他们用羽化筛到突变品系后，更重要的是用标准检测运动的昼夜节律之方法看个体的昼夜活动是否变化，结果发现确实突变果蝇的运动昼夜节律异常。有趣的是，他们发现的三种品系的突变果蝇在表型上并不相同：一种没有节律，一种节律周期长短加快到19小时，一种节律变慢到28小时。他们进一步将突变种与已有的其他突变交配，确立三种突变在染色体图谱的大概位置，结果发现很近，他们进一步把三种突变相互交配，进行本哲发明的顺反检测，试图确立它们是否同一基因，他们根据得到的结果推测三种突变可能是同一个基因的不同突变。他们把这个基因命名为period（简写per），无节律的为per0（per zero）、节律短的为pers（per short）、节律长的为perl（per long）。这里需要说明，他们进行的顺反检测并不严格，只做了反位（trans）的检测没做顺位（cis）的检测，所以只从1971年的文章不能*断定三个突变是否同一基因，虽然当时的结果支持这一可能。

他们筛选的果蝇数量不多，却得到了一个基因的三种不同方向的突变，因此显得特别有运气。

各种筛选和检测生物钟的方法，都有可能在一些非生物钟关键的基因导致的突变而有所影响。同一个基因可以出现三个方向的突变，不仅是运气，而且对于这个基因的功能也提供了很好的支持：很难设想不参与驱动生物钟的基因可以导致三个不同方向的突变表型。如果三个突变确为一个基因的三种突变，那么per基因很可能是生物钟的关键基因之一。

果蝇与哺乳类是否有类似的分子机理？

如果果蝇的per基因只是在果蝇和昆虫起作用，那么意义就有限。如果找到高等动物的Per并因此开启研究高等动物生物钟的分子机理，那么意义就较大。

果蝇的per基因在1984年被克隆后，长期有人（如麻省大学伍斯特校区的Steven Reppert）试图在高等动物中找到Per基因，但无果。一般来说，一个基因在低等动物中发现后，在高等动物中比较容易找到，有多种方法可以通过DNA序列相似性找到。找不到有几种可能：Per在高等动物不存在，例如果蝇的生物钟可能高等动物的生物钟不同，也可以是果蝇和高等动物生物钟大体类似但其中有分子不同（如果蝇用per但高等动物不用）；另一可能是研究者技术上的问题，在高等动物存在Per基因，但未被找到。从1984年到1997年的努力都找不到哺乳动物的per基因的情况下，很多人灰心地认为恐怕哺乳类无Per。

1997年，两个实验室歪打正着，找到老鼠和人的Per（Tei et al., 1997；Sun et al., 1997）。美国华人科学家在研究其他问题的时候，发现一个基因与per有序列相似性（Sun et al., 1997）。比较它们后知道，以前没找到的原因是哺乳类的Per与果蝇的per基因在整个基因的相似性不很高，而局部很高。以前用整体去找很难找到，而用局部的困难在当时并不知道哪段是保守的。

哺乳类的Per基因有三个：Per1、Per2、Per3（Shearman et al., 1997），Per基因表达在SCN（Shearman et al., 1997），其表达随昼夜节律变化而变化，这一节律受Clock基因的调节（Jin et al., 1999）。

1998年，霍尔—罗斯巴希组通过遗传筛选，也在果蝇找到Jrk基因，发现就是果蝇的clock基因（Allada et al., 1998）。有趣的是，Steve Kay实验室发现clock蛋白可以激活带有per基因启动子片段E-box驱动的荧光素（luciferase）报告基因的表达，这一激活能被per自身所抑制，从而较好地实现负反馈环路的闭合（Darlington et al., 1998）。

首先在果蝇发现的per基因终于在哺乳类找到了，而首先在老鼠发现的基因Clock也在果蝇中发现了，从昆虫到哺乳类，生物钟的基因看来高度保守。这虽然是基因水平，但提示机理也保守。

从研究来说，钻研果蝇生物钟的科学家们就不用再担心是自己怪癖，而确实可能是探讨和揭示动物相通的普遍机理。